2017醫學碩士研究生開題報告范文
一、立題依據(科學意義及國內外現狀分析及參考文獻)
惡性黑色素瘤是一種高度惡性且最具侵襲性的癌之一，多發生于皮膚，早期發生血行轉移。對放、化療不敏感，在世界范圍內發病率增高，人們一直在期待著可以征服惡性黑素瘤的新的療法的出現!
最近大量的數據表明惡性腫瘤的發展與T-鈣粘蛋白的表達變化相關.T-鈣粘蛋白已在乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌[1-3] 、胃癌、胰腺癌、卵巢癌[4-9]等多種惡性腫瘤中被檢測到表達減少.最近的研究表明T/H—鈣粘蛋白在乳腺癌中的重新表達能抑制腫瘤細胞的生長,降低體外培養的腫瘤細胞的侵襲潛能[1].T/H—鈣粘蛋白這個新型鈣粘蛋白分子在人類許多癌細胞中表達都降低表明它或許在腫瘤細胞的侵襲和轉移[10]及維持正常細胞的表型中起重要作用[11].
T/H—鈣粘蛋白與腫瘤的發生、發展有著密切的聯系,也許它會為腫瘤的診斷和治療帶來新的契機.
T-鈣粘蛋白是否對惡性黑色素瘤也有作用，目前還沒有相關研究的報道，所以本實驗將進行相關方面的探討性研究!
二、研究內容及預期成果(說明具體研究內容、創新點及擬解決的關鍵問題、預期成果及提供形式)
研究內容：
第一部分：正常表皮組織、痣細胞及黑色素瘤細胞中T-cadherin表達情況
第二部分 T-cadherin基因克隆和真核表達載體的構建
第三部分：T-cadherin基因的真核表達及生物活性分析
創新點：首次將T-cadherin基因轉染黑素瘤細胞
擬解決的關鍵問題：通過RT-PCR反應擴增出T-cadherin的基因全長。
預期成果及提供形式：
觀察T-鈣粘蛋白在正常皮膚組織細胞、痣細胞及黑色素瘤細胞中的表達情況!
進一步闡明T-鈣粘蛋白作用機制
T-鈣粘蛋白基因轉染入黑色素瘤細胞后觀察對其增殖和轉移活性的抑制情況，探索臨床診斷和治療黑色素瘤及其它腫瘤的方法!
三、研究方案(包括研究方法、技術路線、研究進度安排)
研究方法：
第一部分：正常表皮組織、痣細胞及黑色素瘤細胞中T-cadherin表達情況
免疫組織化學和免疫細胞化學
1.材料：從正常人皮膚切取的痣組織，人黑色素瘤細胞株
2.主要試劑和溶液
(1)第一抗體：兔抗人T-cadherin 抗體
(2)第二抗體：生物素標記羊抗兔IgG
(3) “三抗” ：鏈親和霉素標記HRP
3.設備
4.方法
(1)冷凍切片的免疫染色程序
(2)活細胞的免疫染色程序
5.熒光顯微鏡檢
注意：為保證結果的可靠性應該同時設有對照
陽性對照(正常組織) ;
陰性對照(PBS代替一抗)以證明抗體的特異性。
第二部分 T-cadherin基因克隆和真核表達載體的構建
1.材料：
(1)組織和細胞
(2)菌株與質粒
(3)工具酶
(4)試劑
(5)儀器
2.方法
(1)引物的設計
(2)總RNA的提取：異硫氰酸-酚-氯仿抽提一步法
(3)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分析其質量，觀察所提RNA有無明顯降解;
(4)逆轉錄RT反應 ：為了證實RT反應的成功設管家基因GAPDH為內對照
(5)PCR擴增 ：利用上下游引物，在DNA聚合酶下對目的片段進行擴增，PCR過程設β-actin為內對照
(6)PCR產物的回收、純化
(7)PCR產物的克隆
(8)DNA序列測定
(9)真核重組表達質粒的構建
(10)陽性重組質粒的鑒定和篩選
(11)質粒的大量提取
(12)轉染黑色素瘤細胞
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